添加生物素：提高血清生物素水平、改变蹄底部角质样本物理性质
| 2019-04-06 15:21 访问量：530 | [ 字号：大 中 小 ] |
H. Higuchi, T. Maeda, M. Nakamura, A. Kuwano, K. Kawai, M. Kasamatsu, H. Nagahata
日粮中添加生物素对 40 头荷斯坦奶牛血清生物素水平和蹄底部角质物理性质的影响已经有了评估结果。这些结果表明，日粮中添加生物素可引起血清生物素水平的升高，并导致蹄底部角质的物理性质和脂肪含量的变化。
蹄病是乳品行业中最严重的问题之一。它导致产奶量和繁殖能力下降，缩短产奶寿命。蹄病可由多种因素引起，包括牛舍条件、奶牛自身行为、遗传因素、药物感染和营养摄入。正常奶牛血清生物素水平与蹄病奶牛血清生物素水平明显不同，且与趾蹄质量密切相关。生物素，类似维生素B1，是一种含硫的水溶性维生素。 在其8个同分异构体中，只有D-biotin 具有生理活性，是唯一自然产生的形式。生物素作为酶的辅助因子，在糖原生成、脂肪酸合成和氨基酸分解代谢中起关键作用。生物素对表皮组织的正常分化是必不可少的，角质的正常产生和爪角组织的角化都需要生物素。蹄病患病过程中，趾蹄结构的变化与生物素缺乏的小牛犊情况类似。添加生物素对奶牛蹄病具有防治效果。然而，生物素对趾蹄物理性能的影响尚不完全明确。因此，本研究的目的是研究添加生物素对荷斯坦奶牛血清生物素水平及蹄底部物理特性的影响。
材料与方法
试验动物
这项研究是在日本北海道酪农大学的一个实验农场进行的。采用随机抽样的方法，将40头2.8~7.2岁的荷斯坦-黑白花奶牛随机分为添加生物素组和对照组，每组20头。每组奶牛随后进行配种以便进入泌乳期。所有奶牛都被放在混凝土地面、有栓绳的牛舍里。每个牛舍都在橡胶垫上铺上一层约10 cm厚的大麦秸秆。根据日本饲养标准，给奶牛饲喂青贮草、紫花苜蓿和精料，每天挤奶两次。平均305天产奶量为8623±2158 kg。添加生物素组每头牛每天被喂食含20 mg D-生物素的50克饲料。
血清生物素水平
在开始补充生物素之前和试验期间的每个月，从每头牛的尾静脉抽取10mL的血样，并允许凝块。血清生物素水平采用拜耳、Benhur（人名）和 Wilchek（人名）描述的酶联法测定。
蹄底部健康状况与修蹄
趾蹄功能障碍的诊断依据是临床症状，包括疼痛、跛行和异常姿势，角质的病变包括足底和蹄侧壁大面积的变黄、变红。我们在试验开始时和试验期间每月一次检查趾蹄的情况，没有发现任何奶牛的趾蹄异常。在试验开始时和试验期间第6个月进行了修蹄。
蹄底部的物理特性
在添加生物素之前和10个月后分别测定了蹄底部的物理性质。每头牛的前蹄和后蹄的内趾外趾都被刷过，角组织被切割到大约1到2mm的深度，形成一个干净的表面。采集到约2~3mm的角组织样品；取样点如图1 所示。样品在180℃下干燥5小时，计算其含水量。硬度在蹄底部尖端用硬度计按照Baggot,Bunch, and Grill 的方法测量了3 次。
图1 奶牛蹄底部区域图解区域图解, 包括取样点 (●)
角小管形态
用Kuwano法在生物素补充开始前和补充10个月后进行形态学分析。简单地说，后蹄外趾的蹄底部角质样本(图1)用10%中性福尔马林固定，在乙醇中分级脱水，并嵌入树脂中。聚合后，用金刚石锯将切片切割至0.5~1.0mm 宽，然后研磨至30~40μm 厚。切片用苏木精和伊红染色。
蹄底部角质的总脂含量
开始补充生物素之前和补充10个月后用Scaife、Meyer和Grant法测定蹄底部角质的总脂含量。将后蹄外趾的蹄底部角质样本(图1)用木锉锉成细屑。在室温下连续地每间隔1 小时在超过15 倍氯仿（2:1）中进行脂质提取。分离总脂，测定脂肪重量。
结果
血清生物素水平
血清生物素水平的变化如图2 所示。 添加生物素10个月后，添加生物素组奶牛血清生物素平均水平为1163.2 ±76.2 pg/mL,显著高于对照组奶牛 (P = 0.007) (382.0 ± 76.2 pg/mL)。
图2 血清生物素水平添加生物素奶牛组 (●) 与对照组奶牛 (○) （星号*表明与对照组奶牛的平均值有显著差异）
蹄底部角质硬度
在补充生物素之前，两组牛的蹄底部角质硬度相近(表1)。在补充生物素10个月之后，添加生物素组奶牛的前蹄的内趾与外趾硬度分别为(52.0±4.9和51.7±3.4单位)显著高于对照组奶牛分别为(45.2±4.3和43.8±5.2单位)。补充生物素10个月后，添加生物素组奶牛的后蹄的内趾与外趾硬度分别为(47.5±2.7和46.9±3.2单位)也显著高于对照组奶牛分别为(42.8±3.0和42.1±3.5单位)。
表1 添加生物素前后奶牛蹄底部角质硬度的变化
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硬度（单位）
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蹄与趾
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补充生物素的月数
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添加生物素组
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对照组
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前蹄
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内趾
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0
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44.0±4.2
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44.8±5.3
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10
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52.0±4.9a
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45.2±4.3
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外趾
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0
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42.8±3.7
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43.6±5.4
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10
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51.7±3.4a
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43.8±5.2
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后蹄
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内趾
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0
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42.2±2.6
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41.9±2.2
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|
10
|
47.5±2.7b
|
42.8±3.0
|
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外趾
|
0
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43.2±3.2
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43.0±5.1
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10
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46.9±3.2b
|
42.1±3.5
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注：a，b表示与对照组差异显著（下表同）
蹄底部角质水分含量
在添加生物素之前，两组牛的蹄底部角质水分含量基本相同(表2)。在补充生物素10个月之后，添加生物素组奶牛的前蹄的内趾与外趾水分含量分别为(37.1%±3.3%和36.1%±4.1%)显著低于对照组奶牛(44.0%±2.9%和42.1%±2.1%)。在补充生物素10个月之后，添加生物素组奶牛的后蹄的内趾与外趾水分含量分别为(44.2%±2.9%和43.1%±3.0%)也显著低于对照组(49.3%±3.5%和47.6%±3.2%)。
表2 添加生物素前后奶牛蹄底部角质水分含量的变化
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水分含量（%）
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蹄与趾
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补充生物素的月数
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添加生物素组
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对照组
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前蹄
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内趾
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0
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42.5±2.6
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43.3±2.2
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10
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37.1±3.3a
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44.0±2.9
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外趾
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0
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42.2±2.3
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41.0±3.0
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10
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36.1±4.1a
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42.1±2.1
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后蹄
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|||
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内趾
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0
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48.5±4.3
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48.9±2.9
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10
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44.2±2.9b
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49.3±3.5
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外趾
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0
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48.2±5.6
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48.5±3.8
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10
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43.1±3.0b
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47.6±3.2
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牛蹄角小管形态
添加生物素组与对照组奶牛的角小管无形态差异(图3和图4) ，两组牛的左蹄与右蹄、内趾与外趾均无形态差异。
图3 牛后蹄外趾角小管添加生物素组
图4 牛后蹄外趾角小管对照组
蹄底部角质总脂含量
在添加生物素之前，两组牛的蹄底部角质总脂含量相近(表3)。在添加生物素10个月之后，添加生物素组的总脂含量平均值(32.2±3.2 mg/g)显著高于(P=0.030)对照组(26.2±3.0mg/g)。两组牛右蹄与左蹄、内趾与外趾之间的蹄底部角质总脂含量没有发现明显差异。
表3 添加生物素前后蹄底部角质总脂含量变化
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添加生物素月数
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总脂含量（mg/g）
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添加生物素组奶牛
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对照组
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0
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23.8±2.6
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25.2±2.8
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10
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32.3±3.2a
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26.2±3.0
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论述
添加生物素对奶牛蹄病具有预防效果。本项研究我们检测了添加生物素对荷斯坦奶牛血清生物素水平及蹄底部角质物理特性的影响。在添加生物素1个月后，添加生物素组奶牛的血清生物素平均值就明显高于对照组。趾间角质在3个月后开始从基底层向角质层增长。添加生物素组牛的血清生物素浓度仍然很高，表明10个月的评估期间足以评价其对趾间角质的影响。
添加生物素组奶牛的前蹄和后蹄的蹄底部角质明显比对照组硬。趾间角质的硬度取决于角质的水分含量，硬度与水分含量呈负相关。添加生物素组奶牛的前蹄后蹄的内趾外趾的水分含量明显低于对照组，表明角质硬度的增加是由于含水量降低所致。
水分含量与微体系结构（角小管和管间角质）以及角质的生化组成有关。角小管和管间角质是由硬蛋白和脂肪组成的，是调节趾间角质水分含量的关键。优质角质每平方毫米有大量的角小管，角质硬度与单位面积的管数直接相关。我们发现添加生物素组奶牛与对照组奶牛的角小管和管间角质没有形态差异。在一项对添加生物素的马的研究中，发现在补充生物素16个月后管状结构已经改善，而且骨髓比以前更小，尽管他们在显微镜下观察到了一些腐烂的皮质细胞。我们推测，补充生物素10个月足以评价角质的物理性质，但不足以评价组织学的改善。
角质的含水量也与角质的生化组成有关。生物素是酶的辅助因子，在糖原生成、脂肪酸合成和氨基酸分解代谢中起着关键作用。在本项研究中，蹄底部角质的总脂含量，添加生物素组显著高于对照组。脂类对调节蹄趾的透水性至关重要。结果表明，添加生物素引起的蹄底部总脂含量的增加是导致添加生物素组奶牛蹄底部角质硬度和含水量变化的因素之一。
本项研究是在1 个牛群中以同1 种日粮配方喂食和同1 种饲养条件下进行的试验。因此，有必要用同样的试验设计来检验其他奶牛场中荷斯坦奶牛添加生物素的效果。我们的研究结果将促进进一步的研究，旨在阐明添加生物素对预防和改善蹄趾病的作用机制。
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